IPS诱导肠类器官培养的过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。接下来我们将重点讨论第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

在进行内胚层分化前，需要进行充分的试剂与设备准备：

• 细胞来源：H1/H9hESC或患者来源的iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基(abs9403)、RPMI1640(abs9484)。
• 消化液：人多能干细胞消化液(abs9409)。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、双抗(abs9244)。
• 生长因子：ActivinA(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。
• 基质胶：即用型基质胶(abs9410)、类器官专用基质胶(abs9495)。
• 血清：透析胎牛血清(abs945)。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

二、试剂配制

接下来是不同培养基的配制：

• 内胚层分化培养基：
  - 第1天：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM) + 双抗(1%) + ActivinA(100ng/mL)。
  - 第2天：第1天配方 + 透析胎牛血清(0.2%)。
  - 第3天：第1天配方 + 透析胎牛血清(2%)。
• 中/后肠分化培养基：RPMI1640 + 透析胎牛血清(2%) + FGF4(500ng/mL) + WNT3a(500ng/mL)。

三、hPSCs传代与铺板

细胞传代过程大约需要2小时：

1. 使用人多能干细胞消化液处理hPSCs，直到细胞边缘卷起。
2. 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，并反复吹打至1-2mm大小的细胞团。
3. 按1:6的比例将细胞接种至Matrigel包被的24孔板中，每孔大约5000个细胞团。
4. 轻敲培养板确保细胞均匀分布后，置于37°C培养箱中过夜。

在3-4天内将细胞扩增至85-90%的融合度，每日更换人多能干细胞培养基并观察细胞密度。注意：若细胞密度过高（自发分化）或过低（分化效率低），需重新铺板。

四、内胚层分化

此过程持续3天：

1. 第1天：吸除人多能干细胞培养基，加入无血清的内胚层培养基，培养24小时。
2. 第2天：更换为含0.2%透析胎牛血清的内胚层培养基，培养24小时。
3. 第3天：更换为含2%透析胎牛血清的内胚层培养基，培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）：采用免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

五、中/后肠模式化

该过程持续3-4天：

1. 诱导球状体形成：吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，并每日更换。48小时后，通过立体显微镜观察上皮增厚，72-96小时后球状体（spheroids）从单层细胞中脱落。
2. 收集球状体：使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，并置于冰上保存。

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