尊龙凯时实验目的：

1. 学习利用紫外分光光度法测定生物样品中蛋白质含量的基本原理；

2. 掌握紫外分光光度法应用于蛋白质含量测定的技术要点；

3. 熟悉UV-1700PC紫外-可见分光光度计的操作方法，并了解该仪器的主要结构。

实验原理：

紫外-可见吸收光谱法，又称为紫外-可见分光光度法，是一种分析化学技术，针对分子在190nm至750nm范围内的光吸收特性进行研究。此方法基于溶液中分子对特定波长光的选择性吸收，分子外层价电子的跃迁导致吸收光谱的形成。在定性分析中，通常利用光谱比较法进行比对，将未知样品的吸收光谱特征与已知样品进行对比；在定量分析中，应用朗伯-比尔定律（A=lgI0/I=εbc），表明在一定浓度范围内，物质的吸光度A与其浓度c呈正比关系。通常在最大吸收波长λmax处测量吸光度以获得最佳灵敏度。

紫外-可见分光光度计：

该仪器由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器五个主要部分组成。光源发出的复合光通过单色器生成特定波长的平行单色光，样品池中的溶液吸收光后，检测器产生的光电流由信号显示器直接给出吸光度A。在可见光区，常用钨灯和玻璃吸收池；在紫外光区，采用氘灯和石英吸收池。

实验采用紫外分光光度法进行蛋白质含量的测定，主要原因如下：

1. 蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键，使其在275-280nm波长范围内呈现明显的紫外吸收峰。根据朗伯-比尔定律，蛋白质溶液在其最大吸收波长处的吸光度与浓度成正比，适合进行定量分析，浓度范围为0.1-10mg/mL。

2. 测量准确度的限制：由于不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量不同，其微环境也不尽相同，从而导致在280nm处的吸光度存在差异。因此，对于浓度为10mg/mL的1800种蛋白质，280nm处的吸光度区间为0.3-3.0，平均值为1.25±0.51，显示出测量的准确度略有不足。

3. 涉及干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤和嘧啶等分子，测定280nm处的蛋白质含量时可能会遭遇较大干扰。核酸在260nm处的光吸收更强，可以利用280nm与260nm的吸收差计算蛋白质含量。常用公式为：蛋白质浓度（mg/mL）=145A280-0.74A260。

4. 稀溶液中蛋白质浓度的测定：蛋白质的肽键在200-250nm范围内具有明显的紫外吸收，灵敏度随波长降低而加强。在215nm和225nm处测定可减少干扰，常用公式为：蛋白质浓度（mg/mL）=0.144(A215-A225)。

仪器与试剂：

仪器包括UV-1700PC紫外-可见分光光度计、10ml比色管5个、吸量管；试剂包括标准蛋白质溶液（300mg/mL）、0.9% NaCl溶液及待测蛋白质溶液。

实验步骤：

一、准备工作：
1. 启动计算机，开启主机电源，初始化仪器；
2. 在工作界面选择测量项目（光谱扫描或光度测量），设置测量条件；
3. 将空白溶液放入测量池，校零；
4. 制作标准曲线。

二、测量过程：
1. 吸取2mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，使用0.9% NaCl溶液稀释并摇匀，测量吸光度；
2. 制作标准曲线：吸取不同体积的标准蛋白质溶液稀释后，测定280nm处的吸光度；
3. 测定待测蛋白质溶液：取适量样品，稀释后按上述方法测定吸光度。

三、数据处理：
1. 绘制吸收曲线，确定最大吸收波长λmax=278nm；
2. 以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算平均浓度与标准差，确保实验结果的可信度。在95%置信度下，蛋白质的含量为0641088mg/mL。

在进行生物医疗相关实验时，尊龙凯时的紫外分光光度法提供了一种有效、灵敏的方法来分析蛋白质的含量，为生物医学领域的研究提供了坚实的技术支持。