IPS诱导肠类器官的培养可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第三阶段—类器官的培养过程（为期14-28天）。

一、准备工作

所需试剂和耗材包括人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）、低因子无酚红基质胶（abs9495）、15ml离心管（abs7102）、15ml EP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）以及金属冰盒。

二、操作流程

1. 胶水添加与细胞接种

这是原代操作的关键步骤：

（1）准备工作：a. 基质胶需在金属冰盒中于4℃冰箱中融化过夜；b. 尽可能将枪头和离心管预冷至-20℃，至少30分钟；c. 融化后的基质胶可在4℃下保存，建议两周内使用完毕。

（2）接种要求：在24孔板（abs7035）中，每孔添加25μl基质胶和500-750μl类器官培养基。

（3）接种密度建议按总体积比例：基质胶总量：球状体总体积=25:1（如果不易确定细胞团的沉淀体积，则可加300μl基质胶）。

（4）加胶与混合：向细胞团沉淀中加入基质胶（abs9495），轻轻吹打混匀（注意不要产生气泡），然后进行点板。整个操作需在金属冰盒上进行，以保持基质胶的流动性。

（5）培养：将处理好的培养板放入37℃培养箱中静置40-60分钟使基质胶凝固，接着添加500-750μl类器官培养基A进行培养。约10-14天后，多数类器官直径在200μm-500μm，可进行传代处理。

2. 类器官传代步骤

在类器官数量较多或体积较大时，传代的具体步骤如下：

（1）类器官收集及洗涤：移去培养基，每孔加入1-2ml约4℃的类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，并收集于15ml离心管中，建议以5孔为一组进行处理。

（2）洗涤：添加缓冲液G至14ml，静置于4℃下40分钟或-20℃下5分钟，以软化基质胶。然后在4℃下以300g离心5分钟，观察分层情况。

（3）类器官消化：向样品中添加2-3ml类器官传代消化液D，消化2-3分钟，并观察是否形成细胞团。如果细胞团较多，则可终止消化，之后再加上5倍体积的缓冲液G终止消化，离心去除上清。

（4）再次进行加胶、点板和加液的步骤，恢复操作。整个过程应保持在冰上进行，以确保基质胶的流动性。

三、冻存及复苏

为了确保类器官的存储与后续实验的顺利进行，以下是冻存和复苏的步骤：

1. 类器官冻存

在类器官的指数增长期（一般在传代后第3至第4天，直径约100μm-200μm时）进行冻存尤为重要。收集并洗涤类器官后，添加适量的冻存液F，轻柔混匀后立即进行冻结，避免DMSO对类器官的损伤。使用梯度冻存法，将冻存管放置于-80℃过夜，第二天转移至液氮罐保存。

2. 类器官复苏

复苏前的准备包括将水浴锅预热至37℃，并在超净工作台上进行消毒。在取出冻存管时，迅速将其置于水浴中解冻并轻轻摇晃。解冻完成后，将类器官冻存液转移至离心管中，添加10倍体积的缓冲液G，轻柔混匀后离心去除上清。

最后，执行加胶、点板和加液的步骤，经典操作如前所述，确保维持在最佳条件下培养类器官。

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