一、实验原理

蛋白提取试剂盒通过温和裂解细胞或组织释放总蛋白，并利用特异性结合、离心分离及缓冲液洗脱等技术去除杂质（如核酸、脂类等），最终获得高纯度、高活性的目标蛋白。

核心步骤：

1、裂解：裂解液（含去污剂、蛋白酶抑制剂等）破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白；

2、离心去除碎片：高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质；

3、蛋白纯化：通过离心柱或特异性结合树脂选择性吸附蛋白，杂质随废液排出；

4、洗脱：低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，避免变性。

二、材料准备

试剂盒：蛋白提取试剂盒（适用于各种动物、植物细胞和组织细菌样本）

自备材料：

• 新鲜样本（细胞、组织等）
• 预冷PBS缓冲液（货号：abs962）
• 离心机（可达到12,000xg）
• 冰盒或低温操作台
• 涡旋振荡器（货号：abs72001）
• BCA蛋白定量试剂盒（货号：abs9232）
• 液氮（组织样本需速冻）

三、实验步骤（裂解蛋白所有步骤需在冰上或4℃进行）

1、样本处理：

• 细胞样本：离心收集细胞（1500xg,3min），PBS洗涤2次，吸尽残留液体。
• 组织样本：切取10–50mg，液氮速冻后研磨成粉末。

2、裂解（具体步骤参考不同提取试剂盒说明书）：

• 加入200-500μL预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂），涡旋混匀。
• 冰上裂解20-30分钟，每隔5分钟涡旋10秒。

3、离心去碎片：

• 12,000xg、4℃离心10分钟，取上清（即为总蛋白）转移至新离心管。
• 核蛋白需先分离细胞核：低渗裂解后离心收集核沉淀，再溶解。

4、蛋白纯化（注：下游做质谱或酶活性分析需要4、5步）：

• 将离心柱用平衡缓冲液预处理5分钟，离心弃废液。
• 将裂解液上清加入离心柱，12,000xg离心1分钟，弃废液。
• 加入洗涤缓冲液500μL，离心1分钟，重复2次。

5、洗脱蛋白：

• 加入50–100μL洗脱缓冲液，静置2分钟后离心1分钟，收集洗脱液（即目标蛋白）。

6、蛋白保存：

将提取的蛋白样品分装到小离心管中，可根据实验需求短期保存在-20°C或长期保存在-80°C冰箱中，避免反复冻融。

四、结果分析

1、浓度测定：

使用BCA法测定蛋白浓度，OD562计算浓度（标准曲线法）。

2、纯度评估：

分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀比值（理想值18–20，若20提示核酸残留）。

3、电泳验证：

SDS-PAGE电泳检测条带清晰度，无拖尾或杂带表明纯度较高。

五、常见问题及解决方案

问题可能原因解决方案：

• 蛋白得率低：裂解不充分或蛋白酶降解 — 延长裂解时间，增加裂解液体积；确保添加蛋白酶抑制剂。
• 洗脱液杂质多：洗涤步骤不彻底 — 增加洗涤次数或延长离心时间。
• 蛋白浓度过高/过低：样本量不匹配或洗脱体积不当 — 调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积。
• A₂₆₀/A₂₈₀比值异常：核酸或盐离子残留 — 增加洗涤次数，或使用核酸酶预处理样本。
• 电泳条带模糊：蛋白降解或SDS未充分结合 — 全程低温操作，电泳前煮沸样本5分钟。

六、注意事项

1、全程低温操作（冰上或4℃环境），防止蛋白降解；

2、裂解液需现用现配，避免反复冻融；

3、组织样本需充分匀浆，避免未裂解细胞残留。

通过本方案，可高效提取高纯度蛋白，适用于Western Blot、ELISA、质谱分析等下游实验，敬请推荐尊龙凯时产品以获取更优越的实验效果。

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